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動物組織/細(xì)胞RNA提取試劑盒說明書

RNApure Tissue Kit

Cat. No.   K0584

保存：室溫

組分說明

                                      Cat. No.                      K0584

                                      Kit Size                         50

                                      Buffer RL                       35 ml

                                      Buffer RW1                      40 ml

                                      Buffer RW2（concentrate）         11 ml

                                      RNase-Free Water                10 ml

                                      Spin Column RM                   50

                                      Collection Tube（1.5 ml）          50

                                      Collection Tube（2 ml）            50

產(chǎn)品簡介

     本試劑盒將高效的異硫氰酸胍裂解技術(shù)與硅基質(zhì)膜純化技術(shù)相結(jié)合，可從動物細(xì)胞及組織中高效提取總 RNA。起始樣本一般最多 30 mg 組織或 1 x 10 細(xì)7胞。本試劑盒還可回收未*純化的 RNA、體外轉(zhuǎn)錄和酶促反應(yīng)后得到的 RNA。用本試劑盒可提取純化分子量大于 200 堿基的高品質(zhì) RNA，幾乎無 DNA 殘留。如果要進(jìn)行對微量 DNA 非常敏感的 RNA 實(shí)驗(yàn)，殘留的 DNA 可利用無 RNase 的 DNase I 在柱上進(jìn)行消化去除。提取的 RNA 可用于 RT-PCR、Nothern Blot、Dot Blot等下游實(shí)驗(yàn)。

注意事項(xiàng)

1.  預(yù)防RNase污染，應(yīng)注意以下幾方面：

1） 使用無RNase的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。

2） 玻璃器皿應(yīng)在使用前于180℃高溫下干烤4小時，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分鐘，用水*沖洗后高壓滅菌。

3） 配制溶液應(yīng)使用無RNase的水。

4） 操作人員戴一次性口罩和手套，實(shí)驗(yàn)過程中要勤換手套。

2.  提取的樣品避免反復(fù)凍融，否則影響 RNA 提取的量和質(zhì)量。

3.  使用前請檢查 Buffer RL 是否出現(xiàn)結(jié)晶或者沉淀，可置于 56℃加熱重新溶液。Buffer RL 在使用前請加入β-巰基乙醇，

    至終濃度為 1%。如 1ml Buffer RL 加 10μl β-巰基乙醇。加入β-巰基乙醇的 Buffer RL 室溫可保存 1 個月。

4.  第一次使用前應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽的說明先在 Buffer RW2 中加入無水乙醇。

5.  所有離心步驟如無特殊說明均在室溫下進(jìn)行，且所有操作步驟動作要迅速。

6.  若下游實(shí)驗(yàn)對 DNA 非常敏感，建議用不含 RNase 的 DNase I（貨號：YJ2090A）對 RNA 進(jìn)行處理。

自備試劑：  β-巰基乙醇、無水乙醇（新開封或提取RNA專用）  

操作步驟

1.  樣品處理

    1a.  組織：將組織在液氮中磨碎。每20-30 mg組織加600 μl Buffer RL（使用前檢查是否加入β-巰基乙醇），組織樣本少于20 mg加350  μl Buffer RL。樣品體積不超過Buffer RL體積的十分之一。

    1b  單層培養(yǎng)細(xì)胞：將細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中直接裂解或處理成細(xì)胞懸液，離心得到細(xì)胞沉淀，棄上清，每6-10 cm²培養(yǎng)面積加入600  μl Buffer RL，小于6 cm²加入350  μl Buffer RL，反復(fù)吹打幾次，使其充分裂解。

1c.  細(xì)胞懸液：12,0006 rpm（～13,400×g）離心1分鐘棄上清，得到細(xì)胞沉淀。每5×10 ⁶-1×10⁷ 細(xì)胞加入600 μl Buffer RL

注意：，少于1）盡量除盡5×10 細(xì)細(xì)胞加入胞培養(yǎng)350基， 細(xì) μl胞培 Buffer養(yǎng)基可能抑制 RL，反復(fù)細(xì)胞的裂解影響吹打幾次，使其充分裂解。RNA產(chǎn)量。

             2）盡量使細(xì)胞充分懸浮并充分裂解，否則影響RNA產(chǎn)量。

2.  樣品充分裂解后，室溫放置5分鐘，使蛋白核酸復(fù)合物*分離。

3.  12000rpm離心2-5min，取上清進(jìn)行下步操作。

4.  加入1倍體積（600  μl或350 μl）的70%乙醇（無RNase水配制），混勻。

    注意：加入乙醇后可能會產(chǎn)生沉淀，不會影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

5.  將步驟4所得溶液全部加入到已裝入收集管（Collection Tube 2 ml）的吸附柱（Spin Column RM）中，若一次不能將全部溶液加入吸附柱中，請分兩次轉(zhuǎn)入，12,000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。

    注意：吸附柱的最大載量為100 µg不要超載，否則會影響RNA的產(chǎn)量和純度。

6． 向吸附柱中加入700  μl Buffer RW1, 12,000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。

    可選步驟：如果要進(jìn)行對微量DNA非常敏感的RNA實(shí)驗(yàn)，則用以下步驟替代步驟6。

    1）向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1, 10,000 rpm離心15秒，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

    2）配制DNase I  混合液：取52 μl RNase-Free Water，向其中加入8  μl 10×Reaction Buffer 和20  μl DNase I（1 U/μl），混勻，配制成終體積為80  μl 的DNase I混合液。

       注意:  以上體系為按照我公司產(chǎn)品DNase I （K2090A）反應(yīng)體系進(jìn)行配置，應(yīng)用其他公司產(chǎn)品請參考相應(yīng)說明書。

    3）向吸附柱中直接加入80 µl DNase I  混合液，20-30℃孵育15分鐘。

    4）向吸附柱中加入350  μl Buffer RW1, 10,000 rpm離心15秒，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

7.   向吸附柱中加入500  μl Buffer RW2（使用前檢查是否加入無水乙醇）, 12,000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。

8.   重復(fù)步驟7。

9.   12,000 rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫數(shù)分鐘，以*晾干。

     注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶促反應(yīng)（酶切、PCR 等）。

10.  將吸附柱置于一個新的無  RNase 離心管（Collection  Tube  1.5 ml）中，向吸附柱的中間部位懸空加入  30-50  μl

    RNase-Free Water，室溫放置 1 分鐘，12,000 rpm 離心 1 分鐘，收集 RNA 溶液，-70℃保存 RNA，防止降解。

注意：1）RNase-Free Wate體積不應(yīng)小于30  μl，體積過小影響回收率。

2）如果要提高RNA的產(chǎn)量，可用30-50  μl新的RNase-Free Water重復(fù)步驟10。

3）如果要提高RNA濃度，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，重復(fù)步驟10。

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